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Jun 27, 2023

Una cellula

Scientific Reports volume 13, numero articolo: 14123 (2023) Cita questo articolo Dettagli metrici L'enzima di conversione dell'angiotensina II (ACE2) è una monocarbossipeptidasi espressa in più tessuti e

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 14123 (2023) Citare questo articolo

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L'enzima di conversione dell'angiotensina II (ACE2) è una monocarbossipeptidasi espressa in più tessuti e la sua catalisi di peptidi bioattivi regola il sistema renina-angiotensina mediando l'omeostasi della pressione sanguigna. L’ACE2 è implicato in una varietà di malattie, tra cui l’obesità, il diabete e le malattie cardiovascolari, ed è il recettore d’ingresso obbligato per l’infezione da SARS-CoV-2. Le varianti genetiche di ACE2 associate alla malattia vengono sempre più identificate ma sono scarsamente caratterizzate. Per aiutare questo problema, introduciamo un test fluorometrico basato su cellule per valutare l'attività catalitica ACE2 espressa in superficie che preserva la glicosilazione nativa dell'ambiente ospite ed è suscettibile di analisi ad alto rendimento delle varianti ACE2 in piastre multi-pozzetto. Dimostriamo la sensibilità nel rilevare la catalisi dei substrati chiave ACE2, l'angiotensina II, l'apelina-13 e la des-Arg9-bradichinina, e l'impatto di una variante ACE2 cataliticamente carente. La normalizzazione delle misure catalitiche per l'espressione di ACE2 in superficie tiene conto della variabilità nella trasfezione della variante ACE2, nel rilascio in superficie o nella stabilità. Questo test fornisce un approccio conveniente e potente per studiare le caratteristiche catalitiche delle varianti ACE2 coinvolte nelle cascate peptidiche cardiovascolari e nell'omeostasi di più organi.

L'enzima di conversione dell'angiotensina 2 (ACE2) è una proteina transmembrana integrale di tipo I con attività monocarbossipeptidasi espressa sulla superficie cellulare di un'ampia varietà di tipi cellulari e tessuti tra cui polmone, fegato, intestino tenue, tessuto adiposo, rene, cuore e in misura limitata nel cervello1,2. L'ACE2 è meglio riconosciuto come regolatore critico del sistema renina-angiotensina (RAS), dove regola l'omeostasi della pressione sanguigna convertendo il vasocostrittore angiotensina II (Ang II) nel vasodilatatore angiotensina (1-7) (Ang1-7) rimuovendo la sua fenilalanina terminale1,3,4. Funzionalmente, l'ACE2 si oppone alle azioni dell'enzima di conversione dell'angiotensina (ACE) che converte l'angiotensina I in angiotensina II portando ad effetti vasocostrittori, infiammatori e fibrotici attraverso il recettore AT11,3. L'aumento mediato da ACE2 di Ang1-7 promuove una migliore segnalazione tramite il recettore AT1-7/Mas che ha effetti sistemici vasodilatatori, antinfiammatori e antifibrotici sull'epitelio polmonare e su altre cellule in tutto il corpo5,6,7. Oltre a questi effetti ben caratterizzati su Ang II, ACE2 elabora e disattiva i peptidi bioattivi Apelin e des-Arg9-bradichinina (des-Arg9-BK) indipendentemente dalla via RAS8. L'apelina funziona principalmente come vasodilatatore sistemico con conseguente abbassamento della pressione sanguigna, ma è stato dimostrato che causa vasocostrizione in alcuni tipi di tessuti9,10 mentre des-Arg9-BK segnala attraverso il recettore della bradichinina-1 promuovendo effetti proinfiammatori e vasodilatatori11. L'ACE2 è stato collegato a molteplici stati patologici, tra cui obesità12, diabete13,14 e malattie cardiovascolari15,16,17, infezione da COVID-1918,19, comorbidità associate a scarsi esiti di COVID-1920,21,22,23, nonché lunga durata -calo fisiopatologia del COVID-194. Dato l’elevato numero di polimorfismi di ACE2 nella popolazione generale24,25,26 e la recente implicazione delle varianti e della malattia a singolo nucleotide ACE214,27,28,29, sono necessari metodi e test biologici ad alto rendimento per esaminare la relazione tra il genotipo ACE2 e funzione e i loro potenziali collegamenti con la suscettibilità e l’espressione delle malattie.

L'attività della monocarbossipeptidasi ACE2 può essere valutata utilizzando misure basate sulla fluorometria della scissione della fenilalanina sui substrati Ang II e Ap-13, che è stata utilizzata per valutare l'attività catalitica dell'ACE230 ricombinante e solubile. Basandosi su questi metodi, presentiamo un test per la funzione catalitica dell'ACE2 basato sull'ACE2 della superficie cellulare in cellule in coltura in un contesto di trasfezione transitoria. Il nostro approccio preserva la glicosilazione specifica per l'uomo dell'ambiente ospite nativo ed è suscettibile di valutazione ad alto rendimento di grandi librerie di varianti ACE2. Dimostriamo la sensibilità del test alla catalisi dei substrati Angiotensina II (Ang II), Apelin-13 (Ap-13) e des-Arg9-BK, all'inibizione da parte di specifici inibitori ACE2 e per la valutazione di una variante ACE2 priva di attività catalitica. Una caratteristica importante di questo test è un marcatore di tag 3xHA per l'espressione superficiale di ACE2 che viene utilizzato per normalizzare le misurazioni della catalisi, consentendo la valutazione delle librerie di varianti ACE2 tramite trasfezione acuta e per accogliere varianti ACE2 con consegna o stabilità superficiale alterata.